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      Nature子刊:熱量限制完勝!減緩腫瘤進展轉移,增強免疫能力!

      2021-11-04 09:34:35梅斯醫學
      核心提示:Nat Commun:無論飲食成分如何,每日熱量限制比熱量循環更有效地限制了腫瘤的生長

      癌癥發病率隨年齡增長而增加,是死亡的主要原因。熱量限制(CR)有益于健康和生存,并延緩癌癥的發生。然而,由于CR的嚴格要求,提供同樣的癌癥保護的飲食替代品變得越來越有吸引力,這些方法包括改變攝食頻率、飲食組成和或禁食時間等。

      早期的研究表明,短時間的極低熱量攝入,包括短期禁食(2-4天)或特定宏量營養素的飲食控制,可以有效地延緩原發腫瘤的生長。相反,過量食用動物蛋白會增加癌癥風險和全因死亡率。不同形式的間歇性禁食 (IF) 和時間限制禁食(TRF)的主要特征是低熱量攝入或完全禁食的周期,循環穿插在隨意喂養(AL)周期之間。IF和TRF可顯著減少腫瘤生長,并作為化療的輔助劑和癌癥預防工具,具有很好的轉化應用前景。


      然而,目前還不清楚禁食時間、飲食限制水平或營養成分是否是預防癌癥的主要因素。本研究評估了在4T1乳腺癌小鼠模型中,飲食組成與低熱量攝入對延遲腫瘤生長的相對影響。使用小鼠乳腺癌模型,我們比較了每日CR與FMD或等熱量標準實驗室食物的周期性熱量循環對原發腫瘤生長和轉移負擔的效力。

      1、低熱量循環減緩腫瘤生長,與飲食組成無關

      在16周齡的BALB/cJ雌性小鼠中,研究了飲食組成和4:10喂養周期對三陰性乳腺癌(TNBC)生長速率的影響,小鼠植入了乳腺中的同系和高轉移性小鼠4T1癌細胞。比較了4:10循環的FMD與等熱量標準實驗室飼料(AIN-93g),也稱為“低熱量循環喂養”(LCC)的反應。在嚴重低熱量攝入的4天中,FMD和LCC小鼠暴露于50%:70%:70%:70%的日熱量減少,隨后10天用 AIN-93G 日糧飼喂AL(圖1a,補充圖1a)。在注射4T1腫瘤細胞一周后,小鼠接受兩次4:10周期的FMD或LCC(圖。1b),與AL對照組相比,顯示出腫瘤生長速率(圖1c)和腫瘤面積(圖1d)出現類似的下降。在兩個周期中,FMD和LCC小鼠的體重(圖1e,補充圖1b)和食物消耗軌跡(圖1g)相同,28天期間的平均體重(圖1f)和熱量攝入(圖1h)均總體下降。這些結果表明,極低卡路里循環,而不是飲食構成本身,是延遲腫瘤發生的主要驅動因素。

      2、治療性 CR 干預比熱量循環更能減緩腫瘤生長

      先前的研究已經證明CR在延緩乳腺腫瘤生長方面是有效的。我們試圖比較4:10周期的FMD和LCC是否與每日CR一樣有效。每日CR的攝入量以FMD/LCC每4:10循環的平均熱量攝取量為基礎,比AL低約20%。在腫瘤植入后7天,與熱量循環組(FMD和LCC)同時引入一個CR組(如圖2a所示),該組每天接受20%的CR,采用的是AIN-93G飲食(4t1后CR)。在實驗過程中,所有干預均導致體重顯著下降(圖2b,補充圖2a), FMD和LCC小鼠的平均熱量攝入減少了約20%,與每日CR組的限制攝入量相似(圖2c)。

      在處死小鼠時(第二次FMD/LCC循環再飼喂第3天,即CR循環第21天),對各種代謝指標進行評估。CR小鼠的葡萄糖水平呈下降趨勢(圖2d),而FMD和LCC組的胰島素水平和HOMA2-IR值升高(圖2d、e、f)。CR 和 FMD 小鼠的 IGF-1 水平顯著降低,LCC 組也有類似的趨勢(圖2g)。代謝結果的差異突出了日常CR與短期CR之間的差異。

      事實上,CR小鼠在處死前一直處于限制卡路里的狀態,而FMD和LCC小鼠在第二次再喂食期的第三天被處死。這個內在提示可以解釋觀察到的代謝標志物的變化。在進食與禁食狀態下收集的樣本導致代謝標志物和肝臟基因表達的顯著變化。

      因此,FMD和LCC小鼠的肝臟質量增加(圖2h) ,以及代謝標記在重新喂養期開始出現的峰值,可能是對 FMD 和 LCC 小鼠進行為期4天的極低熱量攝入量(70%限制)后,補償性過度進食的結果。對肝蛋白、甘油三酯和糖原含量的評估顯示,在三種飲食模式中,只有總蛋白顯著下降(補充圖2b-d)。每一種干預都導致了腫瘤生長的顯著延遲(圖2i, j)和腫瘤體積的減少(圖2k),特別是在每天喂食CR與喂食AL組中。

      已知腫瘤進展與促進腫瘤免疫細胞的脾聚集(脾腫大)正相關。在每日CR和FMD或LCC周期小鼠的脾臟質量顯著降低(圖2l)。我們推測,腫瘤生長的減少可能是由于促進腫瘤生長的免疫調節細胞數量的減少造成的。免疫組化(圖2m)顯示沒有一種飲食干預能夠降低腫瘤生存能力。因此,無論飲食成分如何,熱量攝入減少和/或禁食時間延長似乎是腫瘤生長下降的關鍵驅動因素。然而,每日CR比4:10周期FMD和LCC在體內延遲4T1腫瘤發生更有效,即使接受的是相似程度的卡路里限制。

      3、CR在延緩腫瘤生長中的預防和治療效果


      為確定在4T1植入前的預防性CR與治療性CR相比,在延緩4T1腫瘤生長方面是否更有優勢,在圖2所示的研究中納入了一個額外的治療組(實驗設計見補充圖3a)。結果顯示無論在4T1細胞植入前還是后啟動,CR在延緩原發性腫瘤生長方面同樣有效(補充圖3m)并降低原發性腫瘤的整體質量(補充圖3o) 和脾臟質量 (補充圖3p)。然而,在兩組荷瘤小鼠中,經H&E染色的腫瘤切片定量的原發腫瘤活力并未因每日CR而降低(補充圖3q)。

      4、CR在減輕轉移性負擔的預防和治療效果

      接下來,我們評估了這些飲食干預措施對4T1細胞轉移擴散的影響。將4T1癌細胞矯形植入BALB/cJ的乳腺,容易轉移到各個部位,提供了一個有用的體內模型來評估每日CR或FMD和LCC循環方案是否可以延緩肺轉移的發展和進展。在28天的4T1腫瘤刺激后,每天進行CR (4T1植入前或后)的小鼠肺轉移性結節顯著減少(圖3a, b)。出人意料的是,FMD 和 LCC 方案沒有帶來這樣的益處,因為與 AL 對照組相比,FMD 和 LCC 小鼠肺中的轉移灶沒有顯著差異(圖3a, b)。CR(4T1 植入前或后植入)的小鼠(比起 FMD 或 LCC )的肺上,有更少肉眼可見的大轉移灶(大小為 >1.5 毫米)(圖3c), 這表明更顯著的轉移性生長。在H&E染色的肺切片中,只有每日CR (4t1植入前后)組的轉移灶顯著減少(圖3d)?傊,CR對TNBC小鼠模型的生長和擴散有預防和治療作用。

      5、預防性CR比熱量循環更能減緩腫瘤生長

      與AL對照組和預防CR組相比,熱量循環組小鼠的平均體重(圖4b)和熱量攝入(圖4c)也出現了類似的下降,CR或熱量循環均未觀察到瘦體重或脂肪量的顯著損失(補充圖1c-e)。

      在處死時(第四個FMD/LCC周期的第3天和CR第49天的重飼)測量的代謝標記物顯示,每天CR小鼠的葡萄糖水平顯著下降(圖4d)。在治療組和AL對照組之間沒有觀察到胰島素水平和HOMA2-IR指數的差異(圖4e, f),盡管在FMD和每日cr喂養的小鼠中IGF-1水平顯著降低(圖4g)。FMD方案導致肝臟重量顯著增加(圖4h),而FMD和LCC方案增加腎臟重量(補充圖4f)。結果表明,在4T1植入前,熱量循環小鼠(FMD和LCC)進行了代謝“啟動”,為代謝適應嚴重熱量限制和AL再喂養的周期留出足夠的時間。

      在4T1植入前,所有干預措施均導致腫瘤生長減少,特別是在每天cr喂養的小鼠中(圖4i, j),腫瘤體積(圖4k)和脾臟重量(圖4l)同時減少。每日CR是唯一能夠顯著降低肺轉移負擔的干預措施(圖4m, n)。這些發現表明,每天CR在降低腫瘤生長速率和轉移負擔方面比熱量循環方案更好。

      6、CR有效減少原發腫瘤切除術后的腫瘤轉移

      與AL喂養小鼠相比,無論是否切除腫瘤,每日CR和FMD或LCC周期在降低平均體重和熱量攝入方面同樣有效(補充圖5b-d)。腫瘤生長28天后,每日CR和周期FMD或LCC導致腫瘤體積減小,脾臟變小。每天進行CR和熱量循環的小鼠在14天后切除的腫瘤體積更小(補充圖5e, f),對于CR和FMD,腫瘤體積顯著減少,LCC組呈下降趨勢(補充圖5g)。第14天切除腫瘤,第28天處死時脾臟變小(補充圖5h)。在切除腫瘤小鼠中,盡管在CR組中觀察到這一趨勢,但沒有任何飲食干預措施能進一步減少轉移瘤的數量。每日CR是唯一能夠限制28天腫瘤負荷小鼠肺轉移形成的干預措施(補充圖5i, j)。這些發現表明,日常CR比周期FMD或LCC更能抑制小鼠肺轉移。

      7、CR程度與延遲腫瘤生長

      由于大多數乳腺癌病例發生在絕經后女性,我們試圖比較不同程度的CR(10-40%)與4:10周期的FMD和LCC在延遲原發腫瘤生長方面的好處(圖5a)。與AL對照組相比,CR水平劑量依賴性地降低了11月齡絕育雌性小鼠的平均體重和食物消耗(圖5b, c,補充圖6a,b)。30%和40%的CR顯著降低了血糖水平,但胰島素水平和HOMA2-IR指數沒有變化(補充圖6d-f)。與年輕的雌性相比,使用FMD或LCC的絕育小鼠顯示出與AL喂養的對照組相似的胰島素水平和HOMA2-IR指數(補充圖6e, f)。只有30%的CR組IGF-1水平顯著降低(補充圖6g)。老年與年輕雌性小鼠的獨特代謝特征表明,年齡和生殖狀態而不是腫瘤負擔本身可能是代謝穩態的更大決定因素。

      CR干預(20-40%)導致原發腫瘤生長率顯著下降和腫瘤體積減少(圖5d, e)。CR組的脾臟重量也顯著降低(圖5 g)。與年輕的雌性不同,FMD或LCC對老年雌性小鼠4T1腫瘤發生沒有保護作用(圖5d, e)。從H&E染色信息顯示,飲食干預沒有改變腫瘤的生存能力(圖5h, l)。因此,似乎20-40%的CR,而不是熱量循環(LCC或FMD),可以延緩生育后女性原發腫瘤的生長。

      20-40% CR組的生殖后小鼠的轉移數量顯著降低(圖5j和補充圖6h),而10% CR組和LCC組則呈現下降趨勢。H&E染色肺切片組織學定量顯示,隨著CR水平的升高,總轉移面積顯著下降(圖5k, l),這與在年輕小鼠中觀察到的轉移負荷變化一致。盡管生殖后的女性肺轉移面積更大(補充圖6j)。

      8、CR程度升高對腫瘤生長延遲的治療作用

      在飼養干預21天后,在處死時評估代謝參數。40% CR顯著降低了循環中的葡萄糖水平(補充圖7e)和IGF-1水平(補充圖7h),而與AL對照組相比,所有治療組對胰島素水平和HOMA2-IR指數均無影響(補充圖7f, g)。治療性CR干預(20-40%),與預防性CR治療一樣,導致原發腫瘤生長速率(補充圖7i, j)和腫瘤體積(補充圖7k)顯著的、劑量依賴的下降。與AL相比,20-40% CR組小鼠的脾臟重量也顯著降低(補充圖7l)。治療性CR(20-40%)也導致轉移瘤數量顯著減少(補充圖7m),包括晚期轉移瘤(大于1.5 mm)(補充圖7n,o)。綜上所述,這些發現表明CR(20-40%)在延遲原發腫瘤生長和轉移負擔方面是有效的,無論它是在4t1接種前還是接種后開始。

      9、CR 和熱量循環導致獨特的免疫特征

      人類和骨髓乳腺癌的生長和轉移需要調節性免疫細胞。因此,我們試圖確定每日CR和4:10周期的FMD和LCC是否導致獨特的免疫特征。FoxP3CD4 Treg細胞和原發性腫瘤區或晚期轉移之間有飲食依賴的正相關關系。與AL對照組相比,每日CR、FMD和LCC周期的腫瘤小鼠外周血中FoxP3+CD4+細胞的頻率顯著降低(圖6a,補充圖8a)。FMD 是唯一能夠顯著降低脾臟 FoxP3CD4 Tregs 百分比的方案(圖6b,補充圖8b)。

      然而,與CR誘導的肺轉移減少相比(圖3),轉移進展沒有受到LCC和FMD的阻礙,這表明有額外的免疫細胞參與。量化FoxP3CD8 Tregs的頻率表明,雖然LCC和CR小鼠外周血中FoxP3+CD8+ Treg水平顯著降低(圖6c,補充圖8c),但CR小鼠脾臟中FoxP3+CD8+ Treg水平顯著降低(圖6d,補充圖8d)。提示CR介導的4T1肺轉移抑制可能是通過抑制這些免疫抑制細胞的激活和上調而發生的。

      未檢測到外周血中MDSCs的頻率有任何變化(圖6e,補充圖8e);然而,它們在CR動物脾臟中的頻率顯著降低(圖6f和補充圖8f)。在LCC和CR小鼠中,FoxP3+CD8+ treg與MDSCs的比值顯著降低(補充圖9a)。CR也顯著增加了脾臟和周圍血液中腫瘤細胞毒性效應器T細胞(Eff CD8和CD4)的頻率(圖6 g-j和補充圖8 g-j)。綜上所述,外周血和脾臟中的三種主要免疫抑制標記物,它們在持續CR中顯著下調。

      10、腫瘤免疫微環境的重塑

      腫瘤微環境(TME)是促腫瘤免疫重編程的主要中心之一。由于腫瘤傾向于免疫抑制環境,我們試圖描述TME內免疫抑制標志物的變化。本研究發現CD4+Foxp3+ treg的數量沒有顯著差異(圖7a,補充圖10a),與先前在CR45濃度為30%的4T1模型中的發現相匹配。然而,在每日CR小鼠中,CD8+Foxp3+Tregs(其水平與不良預后相關)的頻率呈下降趨勢(圖7b,補充圖10b)。

      我們在FMD和每日CR小鼠腫瘤中檢測到MDSCs總量顯著減少(圖7c,補充圖10c)。探索MDSC亞群時僅在CR小鼠中發現PMN-MDSCs的頻率顯著降低,但M-MDSCs的頻率沒有降低(圖7d, e)。這些發現與在乳腺癌患者腫瘤中發現的結果相吻合。CD4+和CD8+細胞中CD103+的表達只有在每日CR小鼠中才明顯升高(圖7k, j和補充圖10h, i)。

      綜上,本研究一項關鍵發現是,每日CR比熱量循環更能顯著減少原發腫瘤的生長。日常CR和其他不太嚴格的CR形式可以限制腫瘤進展。

      另一個關鍵觀察則是在每日CR的外周組織中識別免疫重塑。每天CR能引起CD8和CD4細胞在外周組織增加。在CR喂養的小鼠的TME中,CD4或CD8細胞的數量沒有受到影響,但細胞毒性殺滅潛力被提升。因此,CR可以改造TME,以抑制惡性細胞生長,同時增強T細胞增殖和細胞毒性能力。

      熱量循環(LCC或FMD)對老年女性腫瘤進展的影響減少是這項研究的另一個重要發現。每日CR水平增加(20%或更高),無論在4T1注射前或注射后,都會導致老年女性的腫瘤負擔顯著減輕,而熱量循環組的腫瘤生長速度仍有增無減。

      即使是短期的每日CR,從20%到40%,都能夠顯著減少轉移負擔,而熱量循環(LCC或FMD)是無效的。此外,在原發性腫瘤切除后,熱量循環(LCC或FMD)無法阻止肺轉移進展,而CR則呈下降趨勢。

      總的來說,CR毫無疑問是對誘發和自發癌癥最有效的非藥物干預。本研究結果表明,與每日CR相比,4:10喂養周期的有效性較低,且不能防止肺轉移,無論飲食組成如何或何時治療起始(4t1注射前或后)。重要的是,每天的CR引發一個獨特免疫激活特征,顯著減少腫瘤促進免疫細胞(CD11b+Gr1+)的數量,同時上調抗腫瘤(CD8+和CD4+)免疫細胞。這些發現表明,在4T1小鼠乳腺癌模型中,CR的持續時間和程度是決定對癌癥進展的保護的最關鍵因素。

      原文來源:

      Laura C. D. Pomatto-Watson, et al. Daily caloric restriction limits tumor growth more effectively than caloric cycling regardless of dietary composition.

      NATURE COMMUNICATIONS | (2021) 12:6201 | https://doi.org/10.1038/s41467-021-26431-4 | www.nature.com/naturecommunications

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